例: ApogeeMix フローサイトメーター Cytek Aurora | トミーデジタルバイオロジー株式会社

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フローサイトメーター Cytek Aurora

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Auroraについて

Cytek Auroraに採用されている特許出願中の複数の革新的なテクノロジーによって、フローサイトメトリーに次世代のパフォーマンスと柔軟性・汎用性がもたらされます。

最大4レーザー搭載可能で、3スキャッターch、48蛍光chの検出が可能なAuroraはシンプルなアプリケーションから複雑なアプリケーションまで、すべての研究室のニーズを満たすことができます。従来とは異なる革新的な光学系デザインによって、装置の構成を変更すること無く、様々なアプリケーションで多色の蛍光色素を組み合わせた実験を行うことができます。

最先端の光学系と低ノイズエレクトロニクスが、最高の感度と解像度をもたらします。フラットトップレーザービームプロファイルとユニークな流体経路の組み合わせが傑出した高サンプリングレートをもたらします。

本システムにより得られる高品質なデータによって、アッセイの複雑さにかかわらず、低頻度あるいは曖昧な集団を容易に見つけ出すことができます。

SpectroFlo®ソフトウェアは直感的な操作で、様々なアプリケーションのQCからデータ解析までを簡単に実行できます。

テクノロジー

Auroraの革新的なテクノロジー

ビジョンから現実に

Auroraは最大51ch(48蛍光ch、FSC、ブルーレーザーSSC、バイオレットレーザーSSC)の検出が可能で、以下の革新的なテクノロジーを搭載しています:

  • 高感度な波長分類多重(CWDM)半導体検出アレイによって、420-830nmの蛍光スペクトラムをより高効率に取得可能
  • 51chに渡る広範囲な検出系
  • 信頼性の高い負圧流体システムにより様々なサンプルに対応
  • バイオレットレーザースキャッター、狭いビーム長、フラットトップレーザーデザインによる微小粒子の検出分解能の向上

仕様

光学系

励起光学系

光学プラットフォーム
分割光路に最大5個のレーザーを搭載可能
レーザー遅延時間は装置のQC時に自動調整
レーザー
3レーザー構成: 405nm: 100mW, 488nm: 50mW, 640nm: 80mW
4レーザー構成: 405nm: 100mW, 488nm: 50mW, 561nm: 50mW, 640nm: 80mW
ビームジオメトリー
微小粒子検出用に最適化された狭いビーム高さを持フラットトップレーザービームプロファイル

検出光学系

集光システム
光ファイバーへの最適な収集効率のために、高NAレンズに接合された石英ガラスキュベット
フォワード、サイドスキャッター検出器
FSC: 488nmバンドパスフィルタ付き高性能半導体検出器
SSC: 405nmおよび488nmバンドパスフィルタを備えた2つの高性能半導体検出器
蛍光検出器
レーザー毎に420-830nmの範囲でより効率的なスペクトラム捕捉を可能とする独自の高感度な波長分類多重(CWDM)半導体アレイを搭載
405nm、488nm、640nm(3レーザー構成)および561nm(4レーザー構成)レーザーで励起される蛍光色素にはフィルター交換せずに使用可能
標準光学構成
紫検出モジュール︓420-830nm幅を不等分割し16chで検出
青検出モジュール︓500-830nm幅を不等分割し14chで検出
赤検出モジュール︓650-830nm幅を不等分割し8chで検出
黄緑検出モジュール(4レーザー構成のみ)︓ 570-830nm幅を不等分割し10chで検出

流体系

サンプルフローレート
Low: 15 µL/min、Medium: 30 µL/min、High: 60µL/min、プレートハイスループットモード: 100 µL/min
流体モード
Long clean, SIT flush, Purge filter, Clean flow cell
サンプルチューブ
12x75mm ポリスチレン、ポリプロピレンチューブ
標準液体タンク
液量検出付き4Lコンテナ。20Lシース、廃液互換容器
プレートローダーオプション
96ウェルマイクロプレート対応
サンプルデッドボリューム
5µL(12x75mmチューブ時)

性能

蛍光検出感度
FITC: <110 MEFL, PE: <35 MEFL, APC: <15 MEFL, Pacific Blue: <200MEFL
*3台のシステムによるPHERO Rainbow Calibration Particle (RCP-30-5A)ビーズの蛍光ピークch測定値の平均値に基づく。
蛍光リニアリティ
FITC R2 ≥0.995 / PE R2 ≥0.995
フォワード、サイドスキャッター解像度
リンパ球、単球、顆粒球を識別可能なように最適化
サイドスキャッター解像度
0.1µmビーズとノイズを識別可能
キャリーオーバー
<0.1%
データ取得速度
35,000 イベント/秒

ソフトウェア

SPECTROFLO® SOFTWARE

測定中にライブUnmixing可能
アッセイセットアップの作成、データ取得、ファイル出力
自動QCモジュール
自家蛍光差分
Raw、UnmixedデータをFCS 3.1形式で保存

電気系

信号処理
自動ウィンドウゲート調整付きデジタル信号処理
22-bit 6.5 log decades
1パラメーターあるいは組み合わせによるスレッシュホールド
パルスシェイプパラメーター
各パラメータのパルスAreaとHeight
スキャッターおよび各レーザー毎1蛍光色素のWidth

ワークステーション

オペレーションシステム
Windows® 10 Pro 64-bit
プロセッサー
Intel® Core™ i7 processor, 3.6 GHz
RAM
32GB
HARD DRIVE
500GB SSD / 1TB SATA
ビデオプロセッサー
NVIDIA® GeForce
モニター
32” UHD 4K モニター

設置面積

W x D x H

本体
ローダー無し: 54 x 52 x 52 cm
ローダー付き: 58.4 x 62 x 52 cm
質量
本体 (4レーザー): 80 kg
ローダー: 13kg
コンピューター
29.1 x 9.25 x 34.4 cm
推奨設置スペース
ローダー無し: 157 x 80 x 132 cm
ローダー付き: 162 x 90 x 132 cm

動作環境

電源
AC 100-240V, 50/60 Hz, 最大2A
発熱量
500W
動作温度
17–28°C
動作湿度
20%-85%(結露なきこと)
空気清浄度
過度のほこり、煙が無いこと
照明
特に要求なし

規制状況

研究用です。診断・治療には使用しないで下さい。

ソフトウェア

SpectroFlo®ソフトウェアのガイデッドワークフロー

SpectroFlo®はQCから解析までを簡単に実行出来る直感的なワークフローツールを備えております。

QC and Setup

日次QCを実行することで装置のパフォーマンスをモニター可能

Library

実験テンプレート、ワークシートテンプレート、 蛍光色素情報、QC情報などの追加、削除 が可能

Extra Tools

異なる実験のコントロールを用いたデータの Unmixや仮想フィルターの適用が可能

Users

ユーザー管理が可能

Preferences

デフォルトプロットサイズ、文字サイズとフォン ト、ゲート色、プリントレイアウト、統計テーブルなどの変更が可能

Acquisition

  • Experiment Menu

  • Worksheet Menu

  • Fluidics Menu

  • Plate Calibration

実験ワークフロー

Acquisition menuから3ステップで新たな実験を開始可能です。

  • Step 1:Experimentの作成
  • Step 2:測定
  • Step 3:データのUnmix

プレートローダー

AMSプレートローダー

AMS

AMSは実験を合理化するためにデザインされており、Auroraにシームレスに統合されています。AMSを用いることで、実験目的に合わせたプリセット、あるいはカスタマイズした設定を用いて、低キャリーオーバー、低デッドボリュームなワークフローを簡単に設定できます。

すばやく、簡単に
信頼性96ウェルプレートを用い、生産性を最大化
簡単プレートは数秒で交換可能
3段階のスループットモード
最適化低キャリーオーバーから高スループットまでの3段階の速度設定
カスタマイズモード
カスタマイズアプリケーションやワークフローに合わせカスタマイズ可能

24色データ

幅広い蛍光色素の選択、高い柔軟性、簡単なセットアップ

Auroraの光学設計とSpectroFlo®ソフトウェアのUnmix機能を組み合わせることで、幅広い蛍光色素の選択、パネルの作成、 フィルターの交換を必要としない簡単な機器セットアップが可能になります。Auroraの3chのレーザー構成は、幅広いアプリケーショ ンに適したマルチパラメトリックデータを提供します。ヒト末梢血中の循環細胞サブセットを同定するために設計された24色パネル中 のマーカーおよび蛍光色素を以下の表に例示します。

Specificity Fluorochrome Specificity Fluorochrome Specificity Fluorochrome
CCR7 Brilliant Violet 421™ CD11c BD Horizon™ BB515 CD27 APC
CD19 Super Bright 436 CD45RA Alexa Fluor® 488 CD123 Alexa Fluor® 647
CD16 eFluor® 450 CD3 Alexa Fluor® 532 CD127 BD Horizon™ APC R700
TCR γ/δ BD Horizon™ BV480 CD25 PE HLA DR APC/Fire™ 750
CD14 Brilliant Violet 510™ IgD PE/Dazzle™ 594
CD8 Brilliant Violet 570™ CD95 PE-Cy™5
CD1c Brilliant Violet 605™ CD11b PerCP-Cy™5.5
PD-1 Brilliant Violet 650™ CD38 PerCP-eFluor® 710
CD56 Brilliant Violet 711™ CD57 PE-Cy™7
CD4 Brilliant Violet 750™
CD28 Brilliant Violet 785™

24色パネルにはオーバーラップする蛍光色素が数多く含まれています

  • Violet Excited Dyes Emission Spectra
  • Blue Excited Dyes Emission Spectra
  • Red Excited Dyes Emission Spectra
  • APC/Fire™ and PE/Dazzle™はBioLegend,Inc.所有の商標です。
  • Brilliant Violet™ はSirigen Group Ltd.の商標です。
  • BD Horizon™ とBrilliant Blue (BB) はBD Biosciencesの商標です。
  • Alexa Fluor®、 eFluor®、Super BrightはThermo Fisher Scientificの商標です。 Cy® and CyDye®はGE Healthcareの登録商標です。
  • Allophycocyanin (APC) conjugates: US Patent No. 5,714,386
  • PE-Cy7: US Patent Number 4,542,104. APC-Cy7: US Patent Number 5,714,386.
  • 商標および登録商標はそれぞれの所有者に帰属します。

A New Reality

3レーザー、24色による高解像度解析

微小粒子の検出

例: ApogeeMix

1300nmから110nmのビーズ混合体であるApogeeMix(Apogee Flow Systems)をAuroraで測定した例です。
最小サイズの粒子もバックグランドより高く容易に識別可能です。
データ解析にはDe Novo™ Software社製FCS Express 6を用いました。

自家蛍光の差分

例: PrimeFlow™ RNA Assay

ヒトU937細胞を用いたPrimeFlow™ RNAアッセイを実施しました。 Alexa Fluor® 488によるラベリングしたHMBS mRNAをAuroraで 測定し、低発現(10コピー以下/細胞)の検出性をSpectroFlo® ソフトウェアによる自家蛍光差分無しと有りのデータ間で比較しました。

未染色とAlexa Fluor® 488染色細胞をAuroraで測定したスペクトラムプロット。
2つのスペクトラムは酷似していることがわかります。

  • 自家蛍光差分無し
  • 自家蛍光差分有り

HMBS RNAで染色した細胞と未染色の細胞を混合し、蛍光シグナルを測定。自家蛍光が高いため、ポジティブとネガティブシグナルを判別できません(上図)。自家蛍光差分を実行することで解像度があがり、2つの細胞分画を判別可能となりました(下図)。

近似波長蛍光色素、蛍光タンパク質の識別

いくつかの蛍光タンパク質や蛍光色素の組み合わせでは蛍光スペクトラムのオーバーラップが大きいため(Figure 1, 4)従来のフ ローサイトメトリー技術では識別が困難です。Auroraは全レーザーの全蛍光波長スペクトラムシグネチャーを利用することでこの問題を解消し、共発現を含む集団が識別可能になります(Figure 2, 3, 5, 6)。

例1: APCとAlexa Fluor® 647

Figure 1: APCとAlexa Fluor® 647は従来のスペクトラムビューアーでは激しくオーバーラップしています。

Figure 2: 4レーザーAuroraのスペクトラムプロットからはAPCとAlexa Fluor® 647のシグネチャーを識別可能です。

Figure 3: 健常者の全血サンプルを染色し溶血洗浄し4レーザーAuroraで解析をした例。NK細胞、NK T細胞サブセットの共発現をCD56 Alexa Fluor® 647とCD8 APCの組み合わせから容易に判別出来ます。同一サンプルをCD56 PEとCD8 APCで染色したデータと比較するとNK細胞、NK T細胞の比率が近似することから、Alexa Fluor®647とAPCの組み合わせは結果に影響を与えないことがわかります。

例2: BFP、GFPとmCherry

Figure 4: 従来のスペクトラムビューアーで得られるプロット

Figure 5: 4レーザーAuroraのスペクトラムプロットからはそれぞれのシグネチャーを識別可能。

Figure 6: AB2.2マウスのES細胞を異なるFateマーカープロモーターの制御下でBFP、GFP、mCherryが安定的に発現するよう遺伝子改変ました。異なる環境下で細胞培養し、4レーザーAuroraで蛍光タンパク質解析を行い、自家蛍光差分を行った結果を示します。
サンプル提供元 Luigi Russo, Hannah L. Sladitschek and Pierre Neveu, Cell Biology & Biophysics, EMBL。

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