gRNAシーケンスは興味のある遺伝子に加え、ゲノムの他の領域にも結合する可能性があります。Cas9はゲノムのこのような領域のシーケンスに影響します。このような他の結合サイトは、場所によっては深刻な予期せぬ結果を出す恐れがあります。CRISPRサイトを選択する時は、gRNAのシーケンスが結合するかもしれない他の場所がどのくらい多くあるか、また、それがどのような効果を持つかがポイントになります。GeneiousのFind CRISPR sitesツールでは、ターゲットでない結合サイトを検索することができ、この情報を各CRISPRサイトのスコア計算に使用します。
最初のエクササイズでは、LYP1 CDS内で"GN(20)GG"サイトの全てを見つけるFind CRISPR sites機能を使用しました。このエクササイズでは、Saccharomyces cerevisiaeゲノムに対してオフサイト結合をチェックします。
実行するには、最初にオフターゲット結合サイトに関してテストしたいシーケンスのデータベースを作成する必要があります。-普通これは興味のある生物種の全ゲノムになりますが、他のシーケンス(例えばターゲットベクター)を含めることも可能です。データベースを作るには、Geneiousに新しく空のフォルダを作成し、その中にテストに使いたいシーケンスをインポートして下さい。研究者がテストしたいゲノムの種類が多岐にわたると、ゲノムシーケンスがすごく大きくなる可能性があります。また、新しいバージョンのゲノムアセンブリがリリースされれば、Geneiousには予めダウンロードされた最新バージョンの全ゲノムシーケンスはありません。ゲノムはGeneiousのSourceパネル下(Geneiousの左側にあります)のNCBIフォルダを使って、直接NCBIからダウンロードできます。一般的に研究されているゲノム(例えばヒト、セブラフィッシュ、マウス)は、GeneiousのSample DocumentsのGenomesフォルダでNCBIからダウンロードができます。また、一般的なファイルフォーマットを用いて、他のソースからGeneiousにゲノムをインポートすることも可能です。
このチュートリアルでは、オフターゲットシーケンスのデータベースを自分のために作成します。Saccharomyces cerevisiaeからLYP1内のCRISPR sitesを特定するチュートリアルなので、Saccharomyces cerevisiae内のオフターゲット結合に着目します。Saccharomyces cerevisiaeの完全なゲノムは既にNCBIからダウンロードされ、Yeast genomeフォルダに入っています。シーケンスを見るには、このフォルダを開いて下さい。
Find CRISPR sitesでCRISPRサイトを特定し、オフターゲットを結合を確認するには、LYP1 CDSドキュメントを選択してCloning→Find CRISPR sitesをクリックして下さい。
Find CRISPR Targets横のAnywhere in sequenceを選択して下さい。Target欄には"GN(19)"とタイプし、PAM Site欄には"NGG"とタイプします。Score sites by on-target activityはチェックを入れたままにしておいて下さい。
今回はScore sites through off-target analysis と Score against an off-target databaseにチェックを入れます。次にターゲットでない結合に対してテストしたいシーケンスを含むフォルダを選択します。:横のフォルダマーク(Select a folder)をクリックし、"Yeast genome"フォルダを選択して下さい。Speed and Filter strategyではSlow - score all sitesを選択します。maximum mismatch allowed against the off-targetsは3のまま、maximum mismatch allowed to be indelsは0のままにしておきます。
注意:大きいシーケンスサイトの選択したサブ領域内のサイトを探すようにしていても、Score against an off-target databaseを選択すると、Geneiousはシーケンスの選択されていない領域に対して、オフターゲット結合サイトに関して自動でテストを行います。
今回はオフターゲットのスコアで結果を色付けしたいので、Color CRISPR sites byがoff-target scoreになっているか確認して下さい。これで設定ウィンドウは下図のように見えるはずです。OKをクリックして検索を開始します。