Exercise 2 続き

処理が終わったら、下記のメッセージが出てきます。:


CRICPRサイトを探しているシーケンス(LYP1 CDS)が、酵母ゲノムの一部としてオフターゲットデータベース内にもあるので、このメッセージが出てきます。この領域内のマッチはガイドサイトそのものになりえるので、オフターゲットのスコアリングはされません。

前のエクササイズで、LYP1シーケンスの41 "GN(20)GG" CRISPRサイト群はアノテーションされ、CRISPR Sitesトラック内にグループ化されています。



シーケンスの各CRISPRサイトはどのくらい多くのオフターゲットサイトが潜在的に結合しそうか、どのくらいオフターゲットサイトにオリジナルのシーケンスが似ているかによってスコア化されています。"Off target score"はMITのZhang研究室で開発された方法で計算されています(詳細は こちらをクリックして下さい。)。各オフターゲットサイトはオリジナルのCRISPRサイトにどれだけ似ているか、どこでミスマッチが起こるかに基づいてスコアが与えられます(PAMサイトに近いミスマッチはPAMサイトから遠いミスマッチよりも結合に影響する)。オフターゲットサイトのスコアが高いと、よりオリジナルのCRISPRサイトに似ていることを示します(つまりCRISPR/Cas複合体がオフターゲットに結合しやすい)。CRISPRサイトの全体的なスコアは、100%-(ターゲットゲノム内のオフターゲットスコアの重みづけされた総和)で算出されます。つまり、高スコアなほどオフサイトターゲットにくっつきにくい良いCRISPRサイトであるということです。

シーケンス内のCRISPRアノテーションはCRISPRスコアで色付けされるようになります。色は赤~緑のグラデーションで、アノテーションが赤だとCRISPRのスコアは20%、黄色だと85%、緑だと100%を表します。

Saveボタンをクリックし、シーケンス上にアノテーショントラックを保存します。

Annotationsタブを開きます。アノテーションの表でCRISPRアノテーションのみを表示するには、Typeをクリックし、CRISPRを選択して下さい。Columnsをクリックし、Off-target score#Off-target sitesにチェックして下さい(既に選択されているかもしれません)。選んだカラムがアノテーションテーブルで見られるようになります。

アノテーションの表でカラムの名前をクリックすると、カラムの値順で表の行がソート(並べ替え)されます。小さい三角形がカラム名の隣に現れ、ソートが降順か昇順かがわかるようになっています。カラム名をもう一度クリックするとソートが逆になります。Off-target scoreを昇順に並べ替えて下さい。



この表から、off-target scoresが100%のCRISPRサイトをたくさん見つけられると思いますが、これはインデルが無い、もしくはガイドRNAに3もしくはそれ以下のミスマッチしかないという基準に合うオフターゲットマッチが無いことを示しています(しかし3マッチ以上のオフターゲットサイトはあるかもしれない)。CRISPR guide 41のオフターゲットスコアは最小です。表中でこの行を選択して、Sequence Viewに戻って下さい。"CRISPR guide 41"アノテーションがSequence Viewで選択されています。アノテーションにマウスオーバーすると、黄色いtool tipが現れます。tool tipには、CRISPRに関する情報がより多く入っています。



このサイトのCRISPRスコア(Off-target Score)は83.33%です。Saccharomyces cerevisiaeにはこのシーケンスに対するオフターゲット結合サイトが一つだけありますが、CRISPRガイドと完全に一致しているので、これのオフターゲットスコア(Off-target #1 Score)は100%になります。このサイトはChromosome 14の136,903→136,925のALP1 CDS内にあります。

複数のオフターゲットサイトのCRISPRガイドに関しては、トップ5位までがtool tipに現れます。この情報はAnnotationsタブから見たり、ソートしたり、エクスポートしたりすることができます。

次のエクササイズでアノテーションが混ざらないように、シーケンスからアノテーションを削除します。sequence view内でトラック名横の三角ボタンをクリックし、Delete Trackを選択してSaveをクリックして下さい。


Exercise 3: CRISPRサイトを見つけ、フィルターし、オフターゲットをチェックする
Exercise 4: ペアのCRISPRサイトを見つける