このエクササイズでは、Find CRISPR sites機能で、LYP1 CDSシーケンス上の"GN(20)GG" CRISPRサイトを見つけます。
LYP1 CDSドキュメントを選択し、Cloning＞Find CRISPR sitesをクリックして下さい。
まず、画面左下の歯車ボタンをクリックしてReset to defaultsを選択し、オプションをデフォルト設定に戻します。(今の設定がデフォルト設定である場合は、グレーになっていて選択できません)
シーケンス内のどこかしらでCRISPRサイトを見つけたいので、Find CRISPR Targetsの隣はAnywhere in sequenceを選択して下さい。
検索用にgRNAシーケンスを規定するには、MotifパネルでTarget と PAM の欄を使用します。もし全ての潜在的なCRISPRサイトを評価したい場合は、TargetボックスでN(20)と入れて下さい。もしくは、オフサイト結合をチェックしたい特定のシーケンスを持っている場合は、Target欄にそのシーケンスを入れることができます。このチュートリアルで私たちが興味があるのは、"GN(20)GG"ガイドシーケンスです。このターゲットシーケンスはGN(19)、PAMシーケンスはNGGなので、Target欄には"GN(19)"、PAM Site欄には"NGG"と打ち込んで下さい。プレビュー下でこれらの欄ではターゲットのためのガイドシーケンスやPAMシーケンスが表示されます。- ie GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG
今回の場合、シーケンスのどこに"GN(20)GG"があるのかにのみ興味があるので、Score sites through off-target analysisのチェックを外して下さい。各サイトの活性を評価したいので、Score sites through on-target activityのチェックボックスはチェックしておいて下さい。今、ウィンドウは下図のように見えているはずです。OKをクリックして検索を開始します。
Geneiousは"GN(20)GG"モチーフでシーケンス内のCRISPRサイトを特定し、アノテーション付けします。各"Find CRISPR sites"実行後に出てくるアノテーションは、CRISPR sitesというラベルの新しいトラックでグループ化されます。41個の "GN(20)GG" CRISPRサイトがこのCDS内にあります。
サイトのどれか一つにマウスオーバーしてみましょう。サイトに関する情報がポップアップウィンドウで現れます。この情報にはgRNA結合とサイトのCas9切断の効率の指標となるOn-target activity scoreが入っています。このスコアはDoench et al 2014で計算されます。スコアの大きさは0から1の間で、値が大きいほど期待される活性が高くなります。CRISPRサイトアノテーションはスコアによって自動で緑(高スコア)～黄色～赤(低スコア)の色付けがされます。
次のエクササイズでアノテーションが混ざらないように、シーケンスからこれらのアノテーションを消去します。sequence viewでトラック名の左の矢印をクリックしてDelete Trackを選択して下さい。