Exercise 3: CRISPRサイトを見つけ、フィルターし、オフターゲットをチェックする

前のエクササイズでは、Saccharomyces cerevisiaeゲノムに対するオフターゲット結合に関してLYP1遺伝子上の"GN(20)GG"サイトの全てをスコア化しました。Saccharomyces cerevisiaeゲノムが適度に小さく、LYP1遺伝子上には"GN(20)GG"サイトが少ししかなかったので、検索が比較的早く終わりました。しかし、もしもっと大きいゲノム(例えばヒトのゲノム)に対してオフターゲットサイトをテストしよう、且つ/または、もっとたくさんのCRISPRサイトをスコア化しようとすると、検索にはかなりの時間がかかります。このエクササイズでは、Find CRISPR sitesである代替策を使用して、いくつかのサイトは捨てて、検索をスピードアップさせます。

LYP1 CDSドキュメントを選択し、Cloning→Find CRISPR sitesを選択して下さい。

前のエクササイズ同様、Binding siteの隣はAnywhere in sequenceを選択して下さい。Targetは"GN(19)"、PAM Siteは"NGG"を打ち込みます。

このエクササイズでは、強力なオフサイトマッチのあるCRISPRサイトを捨てるために他の検索方法を使いたいので、Speed and Filter strategyFast - discard more sitesを選択して下さい。off-target databaseはYeast genomeのままにしておきます。

ウィンドウは下図のように見えていると思います。OKをクリックして検索を開始します。



この検索方法を使うと、Geneiousはシーケンス上で5か所だけCRISPRサイトをアノテーションします。



PAMサイトや、PAMサイトの隣の最初の8bpでミスマッチがないオフターゲットマッチを持つサイトが検索から落とされました。この落とされたサイトに関してオフターゲットマッチの更なる検索はされず、5個以上のCRISPRサイトがシーケンス上でアノテーションされることはありません。

次のエクササイズでアノテーションが混ざらないように、シーケンスからアノテーションを削除します。sequence view内でトラック名横の三角ボタンをクリックし、Delete Trackを選択してSaveをクリックして下さい。.


Exercise 4: ペアのCRISPRサイトを見つける