クロマトグラムの編集

DNAクロマトグラムにはしばしばベースコールが曖昧な領域が入っています。非常に小さいDNAフラグメントをシーケンスするのは難しいので、DNAシーケンスリードのスタート位置ではよく起こることです。曖昧な塩基を同定するのに加えて、PCRプライマー配列を除き、シーケンスデータの解析にそれを入れないことが必要になります。

各クロマトグラムドキュメントを開き、編集します。最初にここをクリックして開いて下さい。

"Sequence View"内のAllow Editingボタンをクリックします。これでシーケンスの編集ができるようになります。

プライマー結合位置(プライマー位置がわからない場合は、アノテーションで判別します)に対応するシーケンスとそれに続くシーケンスを除きます。また、シーケンスの開始位置にある品質の悪いデータを除きます。普通はシーケンスの最初の15-20ベースに品質の悪いデータがあります。変更したら忘れずSaveしましょう。

今度は同じ方法で2つ目のシーケンスを編集します。ここをクリックして開いて下さい。

シーケンスのアセンブル

両方の方向でPCR産物をシーケンスするメリットの一つは、もう一方の鎖のリードによってベースコールをチェックできることです。編集した両方のクロマトグラムのファイルを選択して、Align/Assembleボタンの下のDe novo assemble...を選択します。必要であれば、Restore Defaultsを押してデフォルト設定に戻してからOKをクリックして下さい。

アセンブルが終了したら、シーケンスビューのGeneralタブの"Consensus"にチェックを入れます。すると、コンセンサスシーケンスが現れます。必要があれば編集して(Geneious内でシーケンスを編集する際はAllow Editingをクリックすること)、Saveボタンで変更を保存します。塩基を挿入したり消したりしたい場合は、全てのシーケンスで同じポジションを選択して下さい。そうすれば、適切なアライン状態を維持できます。

Question 2:どれだけの塩基がアラインメント内で編集されましたか?- どうしてその編集が必要だったかも簡潔に答えてみましょう。
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アラインメントを編集したら、新しいファイルにコンセンサスシーケンスを抽出します。アラインメントウィンドウで、アラインメントビューの左の"Consensus"をクリックし、 Extractアイコンをクリックします。 ウィンドウが開くので、名前を"Consensus bear bile"にして保存します。

Exercise 3: 未知のシーケンスのBLAST
Exercise 4: 系統樹の作成