クロマトグラムの編集
DNAクロマトグラムにはしばしばベースコールが曖昧な領域が入っています。非常に小さいDNAフラグメントをシーケンスするのは難しいので、DNAシーケンスリードのスタート位置ではよく起こることです。曖昧な塩基を同定するのに加えて、PCRプライマー配列を除き、シーケンスデータの解析にそれを入れないことが必要になります。
各クロマトグラムドキュメントを開き、編集します。最初に
ここ
をクリックして開いて下さい。
"Sequence View"内の
Allow Editing
ボタンをクリックします。これでシーケンスの編集ができるようになります。
プライマー結合位置(プライマー位置がわからない場合は、アノテーションで判別します)に対応するシーケンスとそれに続くシーケンスを除きます。また、シーケンスの開始位置にある品質の悪いデータを除きます。普通はシーケンスの最初の15-20ベースに品質の悪いデータがあります。変更したら忘れず
Save
しましょう。
今度は同じ方法で2つ目のシーケンスを編集します。
ここ
をクリックして開いて下さい。
シーケンスのアセンブル
両方の方向でPCR産物をシーケンスするメリットの一つは、もう一方の鎖のリードによってベースコールをチェックできることです。編集した両方のクロマトグラムのファイルを選択して、
Align/Assemble
ボタンの下の
De novo assemble...
を選択します。必要であれば、
Restore Defaults
を押してデフォルト設定に戻してから
OK
をクリックして下さい。
アセンブルが終了したら、シーケンスビューのGeneralタブの"Consensus"にチェックを入れます。すると、コンセンサスシーケンスが現れます。必要があれば編集して(Geneious内でシーケンスを編集する際は
Allow Editing
をクリックすること)、
Save
ボタンで変更を保存します。塩基を挿入したり消したりしたい場合は、全てのシーケンスで同じポジションを選択して下さい。そうすれば、適切なアライン状態を維持できます。
Question 2:
どれだけの塩基がアラインメント内で編集されましたか?- どうしてその編集が必要だったかも簡潔に答えてみましょう。
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アラインメントを編集したら、新しいファイルにコンセンサスシーケンスを抽出します。アラインメントウィンドウで、アラインメントビューの左の"Consensus"をクリックし、
Extract
アイコンをクリックします。 ウィンドウが開くので、名前を"Consensus bear bile"にして保存します。
Exercise 3:
未知のシーケンスのBLAST
Exercise 4:
系統樹の作成