Gibson Assembly Tutorial: バッチクローニング(応用)

バッチクローニング(応用)

多くの実験では、2つのフラグメントをアセンブルだけ、もしくは1つのベクターに1つのシーケンスを挿入するだけよりも複雑な設定が必要になります。そのため、GeneiousのGibson Assemblyではグループ化したシーケンスドキュメントにバッチで操作できるようになっています。このようなグループ内の各シーケンスは、同じ位置に挿入され、新しい産物や対応するプライマーはそれぞれ交互のシーケンスに対して生成されます。

この例では、様々なプロモーターでのDCN融合遺伝子の発現をテストします。

最初のExerciseで作ったDCN CDSと分解されたベクターと、加えてシーケンスリスト'Promoter'を選択して下さい。このシーケンスリストはNCBIからダウンロードした5つのプロモータのシーケンスリストです。Gibson Assemblyの操作を行って下さい(Cloning > Gibson Assembly...)。

今回は2つのシーケンスがドラッグ&ドロップ領域にあります。茶色っぽいのがプロモーターシーケンスです。これは一つのシーケンスの代わりに一つのシーケンスリストがあることを示しています。DCN CDSの5'側にプロモーターを置きたいので、もし5'側に来ていなければ、プロモーターを5'側にドラッグして下さい。5つの産物が出てくるので、今回はサブフォルダにセーブします(Save in sub-folderにチェック)。他の設定については、前回の解析設定が記憶されています。



解析が終わったら、OKをクリックしてサブフォルダのReport Documentを開いて下さい。すると、'Hints'のセクション以降でリスト化された5つの産物が見えます。プロモータ(Insert 1)のみが変わっています。もっと他にもプライマーがあるので、スクロールして灰色になっている4つのプライマーを見つけましょう。灰色なのは、これらのプライマーがDCN CDSとベクター間のプライマーで5つの産物に共通のものなので、一つだけオーダーすれば良いからです。プライマーをスクロールしていると、これらがとても短いことに気づくと思います。- 一番短いプライマー結合サイトは11塩基のみです。プライマーを手動で調整したり、異なるプロモーターシーケンスを使用して考慮したりしないといけないかもしれないので、長さにはご注意ください。


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