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残ったサンプルを選択しTracesタブからLocus Info ボタンをクリックすると以下の画面が表示されます。:
以下の表の通りに各蛍光標識に対するパラメーターを設定します。(※本設定はマイクロサテライト解析のLocus設定では既知のものです。)
Trace | Expected number of peaks | Repeat Unit | Range Start | Range Stop |
6-FAM | ||||
VIC | ||||
NED | ||||
PET |
OKをクリックします。 他の作業に進む前に以下のウインドが表示されるので、入力したLocus情報に名前をつけて保存したの後にSaveボタンで設定数値も保存します。
Saveボタンを押さなかった場合、Locus情報が保存されず、この先の解析に進めなくなる場合があります
ここで、解析範囲外または検出されていないピーク有無を再度チェックします。 各蛍光標識チェックを外し、1つの蛍光のみチェックした後にGeneious上でピークの確認を行います。
蛍光標識を PETのみ選択した場合、以下の画面となっています。
よく見られるデータのartefactsにはPlus-A, Minus-A, stutter (slippage) ピークのようなもの、pull-up が存在する可能性があります。 ここでは自動的に検出されてしまったそれらの擬陽性ピークが表示されたままになっています。 Plus-A or minus-A (caused by incomplete addition of terminal A nucleotides in the PCR) will be the smaller peak that is one bp away, and stutter peaks are minor peaks that are 1-4 repeat units away from the actual peak.
特に A06 と A09サンプルはPETトレースのために呼び出されていない重複したピークが表示されています。まず、検出されているピークを見てスタッター産物であるかを確認し、短い配列側のピークを1つ削除します。
全サンプルを選択しTraceタブで以下の画面の通りになったらSaveします。
ここまでの作業でLocus情報の設定と正しいピーク検出の調整が完了しました。次にBinningの設定に進みます。