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ホーム > 製品情報 > 【試薬・消耗品】 NGSライブラリ調製キット LOOP GENOMICS

NGSライブラリ調製キット LOOP GENOMICS

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LoopSeq™は既存のイルミナショートリードシークエンサーを、一分子ロングリードシークエンサーとして利用するためのライブラリ調製キットです。独自のテクノロジーで分子バーコード(Universal Molecular Indices: UMI)を与えられたライブラリを、独自のアルゴリズムで解析するための全てが、キットを購入するだけで提供されます。ライブラリ調製のための特別な装置は必要ありません。生データをクラウドにアップロードするだけで自動で解析を行うことができるため、特別な情報解析スキルは不要で、どなたにもお試しいただけます。

図1: LoopSeq™のワークフローは既存の装置を利用して、シンプルな流れで達成される

LoopSeq™キットの独自のテクノロジーで分子バーコードを与えられたライブラリを、独自のアルゴリズムで解析するための全てが、キットを購入するだけで提供されます。生データをクラウドにアップロードするだけで自動で解析を行うことができるため、特別な情報解析スキルは不要で、どなたにもお試しいただけます。解析結果はFASTQ/FASTA,OUT解析、および定量データとして提供されます。(※定量性の有無はキット仕様により異なります。詳細はお問い合わせください。)

LoopSeq™のライブラリ調整とシークエンス

現在は、メタ16S/18S解析用キットをご用意しております。シンプルなワークフローにより得られる分子バーコード付きのライブラリは、たとえば16Sまたは18S ribosomal RNA geneの可変領域全長を疑似ロングリードとして取り扱うことを可能にします。分子バーコード(UMI)を利用しPCR増幅バイアスをキャンセルすることで、シークエンスエラー率を0.005%以下に抑えます。間違って新種と判断されるリスクを減らし、精度の高い分類結果を提供することができる画期的な方法です。

2サイクルのBarcode Assignment PCRにより、目的サイトの5’にバーコードを付加します。末端がバーコードでラベルされた、沢山の分子ができあがります。※バーコード(Loop BC)はサンプル特異的バーコードと分子バーコード(UMI)から成ります。

バーコードを持つ分子の全長を、PCRにより増幅します。

1キットあたり最大24サンプルの、分子バーコード(UMI)ラベル化された分子を混合し、以降の工程はシングルチューブで行います。

分子の末端に付加したバーコード配列を、copy & pasteのようにして増やしていきます。このバーコードの頒布は同一分子内のみでしか起こらないのが特徴です。

バーコードを含む一分子を、ランダムに断片化します。その後、インサートの5’端にバーコードを持つようにライブラリの形を整えます。

長さ600bp程度のライブラリには20種のi7を持たせることができ、最大で480-plexの実験デザインが可能です。

シークエンスは150bpあるいは300bpのペアエンド解析を行ってください。24-plexで3%以上のPhiXの使用が推奨されています。

LoopSeq™ Microbiomeキット

■デザインとパフォーマンス

図2: LoopSeq™ Microbiomeキットでは16Sまたは18S ribosomal RNA geneの可変領域全長をターゲットとしている

図3: LoopSeq™ Microbiomeキットで得られたリードの96%以上が可変領域全長のシークエンスに寄与していた

本キットは16S ribosomal RNA geneの可変領域全長を検出対象にすることができるという点で優れています。一分子疑似ロングリード解析で得られたリードの96%が、V1-V9領域をスパンできていました。測定領域が大きければ、それだけ異なる塩基の数が多くなるので、データ解像度を上げることが有利になります。

図4: LoopSeq™ により、90%以上が種の同定に至る

一般的にショートリードで限られた領域(V3-V4)を見るだけでは、属レベルまで同定することができるのは50-70%程度です。しかし本キットによる一分子疑似ロングリード解析で全長可変領域(V1-V9)を読むと、99%以上で属の同定が可能でした。90%以上は種の同定にまで至りました。(メタゲノミクス研究における標準品:ZymoBioMics Microbial Community Standardを用いたモデル実験、 One Codex社によるデータ提供)

図5: LoopSeq™ では、正確な相対種含有量の見積もりが可能

あらかじめ含有量のわかっているモデルサンプルを用いた実験を行いました。往々にしてPCR増幅によるバイアスは存在の多い種を際立たせ、少ない種を見えなくさせますが、分子バーコードを利用すれば実態に即した種の解析が可能となります。本キットを使えば、理論値と実測値との誤差がほとんど無く、そして0.02%といった非常に存在比の少ないものも、測定可能でした。

図6: LoopSeqTMキットは高い再現性を示す

4サンプルを2つの別のキットで測定したところ、結果はよく一致していました。本キットは再現性が高く、複数回に分けて実験を行う場合にも、安心してお使いいただけます。

■Microbiomeキット商品ラインアップ

16S SSCMicrobiome 24-plex kit
16S&18S SSC Microbiome 24-plex kit
  • ・16Sまたは18S ribosomal RNA geneの可変領域全長を測定対象とし、解像度高く菌種を同定
  • ・インプットgDNAは10ng
  • ・150bpの100-150M PE reads、あるいは300bpの50M PE readsが目安(サンプルにより異なる)
  • ・データ解析はde novoアセンブリ
  • ・UMIによる定量性の有無は実験方式により異なる。フルレングスデータが得られる

LoopSeq™ Mycobiomeキット

■デザインとパフォーマンス

図8: LoopSeq™ Mycobiomeキットでは18SからITS2領域までの全長をターゲットとしている

図9: LoopSeq™ の合成ロングリードでは確かに2,500bpあたりの領域を読むことができていた

本キットではターゲットの全長を検出対象にすることができるという点で優れています。土壌サンプルを測定したところ、合成ロングリードでは確かに2,500bpあたりの領域を読むことができていました。現状のショートリードによるアプローチよりも楽に、多くの情報を得ることができます。

■Mycobiomeキット商品ラインアップ

Mycobiome 18S ITS1 & ITS2 SSC 24-plex Kit
  • ・18SからITS2領域までの全長を測定対象とし、解像度高く菌種を同定
  • ・インプットgDNAは10ng
  • ・150bpの175-250M PE reads、あるいは300bpの50M PE readsが目安(サンプルにより異なる)
  • ・データ解析はde novoアセンブリ
  • ・UMIによる定量性の有無は実験方式により異なる。フルレングスデータが得られる

商品概要

検出対象 Prokaryotes(16S)
Prokaryotes・Eukaryotes・ Archae(16S+18S)
Fungi(18S+ITS1/2)
必要インプットサンプル 10ngのゲノムDNA
キット仕様 24サンプル処理をワンチューブで行うワークフロー
キットは1回使い切り、凍結融解不可
ライブラリ調製に必要な機器 ランピング機能付きのPCR装置
そのほか、一般的なNGSライブラリ調製に必要な機器類一式
推奨するシークエンサー イルミナプラットフォーム
シークエンス条件 2x150bp あるいは 2x300bp、ペアエンド解析
目指すべきパスフィルタークラスター数は、キットにより異なる
PhiXの添加が必要
データ解析 疑似ロングリードFASTA/FASTQを得るためには、クラウド利用が必須

研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用はできません。
同社のロゴおよびLoopSeq™ はLOOP GENOMICS社の商標です。その他全ての商標はそれぞれの所有者に帰属します。
商品ラインアップ、キット仕様およびプロトコルは予告なく変更となる場合があります。

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