よくあるご質問

NGSライブラリ調製関連キットShoreline Biome

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Shoreline Biomeのアッセイキットの使用に制限はありますか?

Shoreline Biomeキットは、現在、研究用としてのみ利用可能であり、再配布できません。もし診断用アッセイ開発のためにShoreline Biomeキットを使用することにご興味がございましたら、info_ap@digital-biology.co.jp までお問い合わせください。

なぜShoreline Biomeアッセイキットは他のキットよりも優れているのですか?

Shoreline Biomeキットは:
・最も完全で使いやすいマイクロバイオームシークエンシングソリューションを提供します。Shoreline Biome アッセイキットは、迅速で包括的なデータ結果を提供するため、経験豊富なマイクロバイオーム研究者にも、初心者の研究者にも、信頼されています。
・Shoreline Biomeアッセイキットは、ショートリードまたはロングリードのシークエンシングデータに必要なアンプリコンを迅速に生成することができ、最高品質の16Sアンプリコンプレップを提供します。直接の比較では、Shoreline Biome独自の技術により、他のキットでは確認できなかった細菌が検出されています。プロセスを開始する前にサンプル量を測定する必要はありません。
・グラム陽性のファーミキューテスやその他の溶解が困難な細菌を包括的に検出する最大96サンプルの簡単な溶解を35分以内に行うことができます。96ウェルプレートフォーマットで構成されているため、シングルステップPCRへのシームレスな移行が可能です。
・独自のデュアルマッチバーコードデザインを採用しており、PCRバイアスを制限し、存在比に応じた出現頻度を維持しながら、既知のPCRプライマーバリアントをカバーしています。
・PacBioプラットフォームと組み合わせて使用すると、Shoreline Biomeの直感的な解析ソフトウェアと特別にキュレーションされたAthenaデータベースを使用して、優れた高解像度の読み出し情報で配列データを簡単に解析することができます。

Shoreline Biomeのキットをまとめて購入したいのですが、どうすればいいですか?一括注文の見積もりを依頼するにはどうすればいいですか?

弊社営業担当、または info_ap@digital-biology.co.jp までご連絡ください。

Oxford Nanoporeユーザーですが、Shoreline Biomeのキットを使用することはできますか?

はい、Oxford Nanopore Technologies社のシークエンサー対応キット Shoreline Complete™ / Wave™ Nano ID™ Kit が2021年3月に販売開始されました。

Shoreline Biomeキットの購入方法を教えてください。

弊社営業担当、または info_ap@digital-biology.co.jp までご連絡ください。

Shoreline Biome 物理的な細胞破砕を提供する製品はありますか?

物理的な細胞破砕を提供する製品はございませんが、最新情報にご期待ください。

Shoreline Biome プライマーは古細菌、細菌、真菌、ウイルスのDNAを増幅しますか?

プライマーは細菌に特化しており、他の生物を増幅することはございません。

Shoreline Waveキットには何が含まれていますか?

Shoreline Waveキットには以下のものが含まれています。

・増幅用PCRプレートシール

・96種類のバーコードプライマーを含む96ウェルPCRプレートまたは16種類のバーコードプライマーを含む16チューブ

Illuminaの場合、これらのプライマーは16S rRNA遺伝子のV1-V3またはV4領域のいずれかをターゲットとしてします。PCR増幅後、Illuminaシークエンシングアダプターを含むアンプリコンをプール、精製しましたら、シークエンシングの準備ができています。
PacBioの場合、これらのプライマーは16S rRNA遺伝子全体または16S-ITS-23S領域のいずれかをターゲットとしています。PCR増幅後、アンプリコンをプールしましたら、PacBio SMRTbell調製の準備ができています。

Shoreline Biome Wave キットに含まれていない追加の材料は何ですか?

PCR 後の洗浄には、Qiagen MinElute? PCR 精製キット (品番28004) が必要です。
その他の必要なものは、ほとんどのラボで共通で、各プロトコールに記載されています。

Shoreline Biome 他のキットで抽出したDNAを Shoreline Wave キットに使用できますか?

はい、可能です。10~100 ngのDNAを推奨しております。
ただし、ビーズビーティングなどの物理的破砕を用いたキットで抽出されたDNAは、Shoreline BiomeのDNAよりも品質が低くなることに注意が必要です。
このため、特にStrainIDキットでは、サンプルから長いアンプリコンを得ることができない場合があります。

Shoreline Biome Rapid PrepではどのようなDNAが得られますか?

Shoreline Biome Rapid Prepキットでは、一本鎖DNA(ssDNA)が得られます。

Shoreline Biome Rapid Prepキットを使用したライシスに推奨されるサンプルインプットは何ですか?

Shoreline Biomeキットは低サンプルインプットに最適化されています。
サンプルを追加しすぎると、アッセイが失敗する可能性があります。以下のガイドラインは、サンプルインプットのライシスに推奨されています。

サンプルタイプ: インプット量: 最大
固形糞便: 1~3 mg: 10 mg
液体糞便: 10 ul: 10 ul
DNA Genotek OMNIgene-GUT: 10 ul: 10 ul
組織: 20 mg: 30 mg
マウス糞便: 5 mg (1/4 ペレット): 10 mg (1/2 ペレット)
細菌細胞: 10^6: 10^8

バッファーの考慮事項: Shoreline Rapid PrepおよびShoreline Complete lysisステップはpHに依存するため、推奨されるサンプル投入量のガイドラインに従うことが重要です。ンプルをpH6.5未満のバッファーに保存する場合は、10 ?Lが最大インプット量となります。
これ以上の量を添加すると、最適な溶解が得られず、下流の結果に影響を及ぼす可能性があります。

Shoreline Biome Rapid Prepキットには何が含まれていますか?

Shoreline Rapid Prepキットには以下のものが含まれています。
・96ウェルプレートまたは溶解用チューブ16本
・DNA精製ビーズのボトルまたはチューブ2本

Shoreline Biome Rapid Prep から分離した DNA はどのような下流のアッセイに使用できますか?

Rapid Prepから分離されたDNAは一本鎖DNAであるため、このDNAはPCR用途のみに使用することをお勧めします。

Shoreline Biome Rapid Prep キットに含まれていない追加の材料を購入する必要がありますか?

磁気ビーズを扱うための磁石が必要です(Invitrogen DynaMag 96 サイド磁気ラック、品番12331D または磁気スタンド96 品番AM10027)。
Invitrogen DynaMag 96 マグネットを強くお勧めします。
ユーザーがこのタイプの磁石で最も成功していることがわかりました。
磁気スタンド96(サーモフィッシャー品番AM10027)は、他の唯一の承認された磁石です。
棒やポストではなくウェル型の磁石を使用したプレート磁石では、DNA の収量が低くなります。

その他の必要なアイテムは、ほとんどのラボで共通で、各プロトコールに記載されています。

Shoreline Biome Rapid Prep キットからはどのくらいの DNA が得られますか?

通常、糞便サンプルでは 100~1000 ng の一本鎖 DNA が得られますが、サンプルの種類によって異なります。詳細については、info_ap@digital-biology.co.jp までお問い合わせください。

Shoreline Biomeのキットを用いたPacBio SequelでのSMRTbellライブラリ調製には、どのようなプロトコールを使用すればよいですか?

お客様は、SMRTbell Express Template Prep 2.0を使用して、「Procedure & Checklist – Full-Length 16S Amplification SMRTbell Library Preparation and Sequencing」を使用してください。
プロトコールを見つけるには、https://www.pacb.com/applications/complex-populations/microbial/ にアクセスし、Library & Sample Preparation セクション(”Learn More +”)を展開し、16S 増幅およびシークエンシングのプロトコールへのリンクをクリックします。
この手順は、PacBioプロトコールに記載されているように、個々のアンプリコンではなく、アンプリコンプールで開始することに注意してください。
すでにプールされたShoreline PCR産物の「AMPure PB Bead Purification」から始め、PacBio特有のプール手順をスキップして、「SMRTbell Library Construction」でプロトコールを再開します。

Shoreline StrainIDを使うメリットは何ですか?

添付ファイルの図は、様々なアンプリコンの利点を示しています。
ここでは137の大腸菌株を見ています。大腸菌の16S rRNA遺伝子は多くの株で類似しているため、全長配列(V1V9)をターゲットにしたとしても、50%程度の株しか分解能が得られません。
StrainIDキットでは、137株すべてを完全に分離して検出することができます。

Shoreline アガロースゲルの代わりにAgilent Bioanalyzerを使ってPCR産物の評価を行うことはできますか?

はい、Agilent Bioanalyzerを使用できます。
通常は最低 96 サンプルを実行しますので、大量のサンプルに Agilent Bioanalyzer を使用することは費用対効果が高くありません。
ただし、サンプル数が少ない場合(16 サンプルなど)は、Agilent Bioanalyzer を使用することをお勧めします。

Shoreline なぜV1-V3を増幅するのでしょうか?

V1-V3領域は、皮膚や口腔内のマイクロバイオームに着目した研究者が主にターゲットとしている領域なためです。

Shoreline BiomeのIlluminaとPacBioのShoreline CompleteキットとShoreline Waveキットの推奨シークエンシングカバレッジはどのくらいですか?

カバレッジは実験デザインや目的に大きく依存するため、各プロジェクトによって必要な条件が異なります。

Illuminaでは、16S解析のために100,000リード/サンプルを推奨しています。
多くの研究者がこれよりもずっと低いリード数で良好な結果を得ています。私たちは、Shoreline Biome V4キットを使用して288サンプルをマルチプレックスし、MiSeq上で十分なカバレッジをシークエンスしました。

PacBioシークエンシングでは、StrainIDキットを使用して、1つのSMRT Cell上で96サンプルをランすることをお勧めします。
これにより、Sequel Iで存在比1%の細菌株を合理的な信頼性を持って検出するのに十分なリード/サンプルが得られます。一般的に、リード数が多いほどサンプルあたりの深度が深くなり、サンプル中の低存在比の細菌を検出することが可能になります。
1% 未満の細菌を識別する必要がある多様性の高いサンプルの場合は、1 セル以上の Sequel I SMRT Cellまたは 1 セルの Sequel II SMRT Cellを使用することをお勧めします。

Shoreline BiomeのV1-V9キットを使用するメリットは何ですか?

V1-V9キットは、16S rRNA遺伝子全体の既存のデータをお持ちで、Shoreline Biomeの溶解やプライマーの技術的な利点も欲しいというお客様のために開発しました。
また、プライマーターゲットがゲノム内で互いに近接して配置されていないため、StrainIDキットでは検出できない細菌がいくつかあります。
特に、Helicobacter 属、Deinococcus 属、Planctomycetes 門の一部などが挙げられます。

Shoreline Biomeのプライマー配列を教えてください。

V1-V3のコンセンサス配列:
・27f AGRRTTYGATYHTDGYTYAG
・515r TYACCGCRRCKGCTGGCAC

V4のコンセンサス配列:
・515F GTGRCAGCKGRRGCGGTYA
・806R GGAYTACNVGGGTHTCTAAK

V1-V9のコンセンサス配列:
・27f AGRRTTYGATYHTDGYTYAG
・1492r TASVGHTACCTTGTTACCGACTT

Strain IDのコンセンサス配列:
・27f AGRRTTYGATYHTDGYTYAG
・R AGTACYRHRARGGAANGR

Shoreline 単離された真菌 gDNAを使用した場合、V1-V9やStrainIDのプライマーセットでターゲット領域を増幅できますか?

現在のところ、Shoreline Biomeのキットには真菌やウイルスを増幅するための適切なプライマーが含まれていないため、V1-V9やStrainIDキットは使用できません。
このアプリケーションの開発プロジェクトは現在進行中ですので、新製品が出た際にはニュースレターでお客様にお知らせいたします。

Shoreline Illuminaシークエンシングプラットフォームを使用しています。Shoreline Biomeアッセイキットは私に適していますか?

はい! Shoreline Biomeでは、Illumina 16Sシークエンシングをサポートする以下のキットをご購入いただけます。
・Shoreline Complete V1-V3キットには、16SのV1-V3領域のシークエンシングするための溶解、精製、増幅用試薬が含まれています。
・Shoreline Complete V4キットには、16SのV4領域のシークエンシングするための溶解、精製、増幅用の試薬が含まれています。
・Shoreline Wave V1-V3キットには、16SのV1-V3領域をシークエンシングするための増幅用試薬が含まれています。
・Shoreline Wave V4キットには、16SのV4領域をシークエンシングするための増幅試薬が含まれています。
これらのキットには、PCRステップ中にアンプリコンに付加されるIlluminaシークエンシングアダプターが含まれています。
さらに、両キットともイルミナシークエンシングに対応した96種類のバーコード標識されたアンプリコンを出力します。
すべてのキットは16チューブまたは96ウェルプレート形式で提供されています。

PacBioのロングリードシークエンサーを使用しています。Shoreline Biomeアッセイキットは私に適していますか?

はい! Shoreline Biomeでは、PacBioシークエンシングに対応した以下のキットをご購入いただけます。
・Shoreline Complete V1-V9キットは、16S rRNA遺伝子の全可変領域をサポートしています。これは、溶解、精製、増幅のための試薬を提供します。このキットでは、約1,500 bpのSMRTbell対応アンプリコンが得られます。全長レベルの16Sアンプリコンは、一般的に種レベルでの細菌の同定につながります。
・Shoreline Complete StrainIDキットは16S-ITS-23Sをサポートしています。このキットには、溶解、精製、増幅のための試薬が含まれています。このキットでは、約2,500 bpのSMRTbell対応のアンプリコンが得られます。StrainIDアンプリコンにより、菌株レベルでの細菌の同定が可能です。
・Shoreline Wave V1-V9キットは、16S rRNA遺伝子の全可変領域をサポートしています。増幅用試薬のみを提供します。このキットでは、約1,500 bpのSMRTbell対応アンプリコンが得られます。全長レベルの16Sアンプリコンは、一般的に種レベルでの細菌の同定につながります。
・Shoreline Wave StrainIDキットは16S-ITS-23Sをサポートしています。増幅用試薬のみを提供します。このキットでは、約2,500 bpのSMRTbell対応アンプリコンが得られます。StrainIDアンプリコンを使用することで、菌株レベルの細菌を同定することができます。

すべてのキットは、16チューブまたは96ウェルプレート形式で提供されています。

Shoreline Biome 使用可能なバーコードの数は?

キットごとに利用可能なバーコードの数は以下のリストを参照してください。

Shoreline Complete/Wave Kit バーコード
V4: 288
V1-V3: 192
V1-V9: 112
StrainID: 112

Shoreline Biome プライマーはすべての細菌をカバーしていますか?

プライマーセットを構築するために、SILVAデータベース(数十万の完全長および部分16S rRNA遺伝子)、Rikenデータベース(NCBIのHuman Microbiome Project(HMP)ゲノム配列データを含む2,275の完全長ゲノム配列および5,664のドラフトゲノム配列)、RefSeqデータベース(2018年12月)からの18,566の完全アセンブルゲノムを有するAthenaデータベースの検索を行いました。
データベースには、ヒト口腔、糞便、皮膚、モデル生物、環境など、様々なソースからの細菌が含まれています。
Shoreline Biomeのデザインは、rRNA遺伝子構造に基づいた既知(配列決定済み)のすべてのバリアントと、予期される未知のプライマーバリアントを含んでいます。
また、潜在的なプライマー枯渇や競合による影響を制限する新しいプライマー設計も行っています。

Shoreline Biome 抽出キットを別途購入する必要がありますか?

Shoreline Completeキットは、サンプルを溶解、精製、増幅することができます。
別途の抽出キットは必要ありません。

Shoreline Waveキットには10~100 ngの精製DNAが必要です。

Shoreline Biome 一回のシークエンシングランでバーコードをプールすることはできますか?

以下のものは、一回のシークエンシングランで一緒にプールすることができます。
その他の組み合わせについては、テクニカルサポート(info_ap@digital-biology.co.jp)までお問い合わせください。

キット: プールできるセット
V4: V4 Sets A, B, C
V1-V3: V1-V3 Set A と B
V1-V9: V1-V9 Set Z と A, V1-V9 Set Z と StrainID Set Z
StrainID: StrainID Set Z と A, StrainID Set Z と V1-V9 Set Z

Shoreline Biome PacBio Sequelでシークエンスする際に、Shoreline BiomeライブラリとShoreline Biome以外のライブラリを組み合わせることはできますか?

バーコードプライマー配列の複雑さとデマルチプレックスソフトウェアの多様性から、同じシークエンシングランで異なるライブラリプレップを組み合わせることはお勧めしていません。

Shoreline Biome 推奨されるコントロールは何ですか?

研究者は独自のマイクロバイオームコントロールを選択することができます。
ZymoやATCCからのいくつかを使用して成功しています。

・プロセスポジティブコントロール:ATCC MSA-2002, MSA2006, Zymo D6300
・プロセスネガティブコントロール:溶解ステップの水
・PCRポジティブコントロール:MSA 1002, MSA1006, Zymo D6305
・PCRネガティブコントロール:PCRステップの水

Shoreline Biomeでは、溶解と増幅の効率、および環境中からのコンタミを監視するために、プロジェクトにコントロールを含めることを推奨しています。

Shoreline Biome どのような種類のサンプルをテストできますか?

Shoreline Complete および Shoreline Rapid Prep キットは、以下に示すように、さまざまなサンプルで検証されています。プロトコールはサンプルの種類によって異なります。
サンプルタイプ: プロトコール
固体糞便、他のバッファーに貯蔵された液体糞便、DNA Genotek OMNIgene-GUT、組織サンプル、マウス糞便ペレット: プロトコール1
綿棒、唾液、ペレット化した細胞: プロトコール2
記載されていないサンプルについては、info_ap@digital-biology.co.jp までお問い合わせください。

Shoreline Biome Lysis-1 チューブにプレートマグネットを使用できますか?

はい、Invitrogen DynaMag-96 Side Magnet (品番12331D)を Lysis-1チューブに使用して成功しています。

Shoreline Biome これらのプライマーは古細菌、細菌、真菌、ウイルスのDNAを増幅しますか?

プライマーは細菌に特化しており、他の生物を増幅することはございません。

Shoreline Completeキットを使用した溶解に推奨されるサンプルインプットは何ですか?

Shoreline Biomeキットは低サンプルインプットに最適化されています。サンプルを加えすぎると、アッセイが失敗する可能性があります。サンプルインプット溶解には、以下のガイドラインを推奨します。

試料の種類: インプット量: 最大
固形糞便: 1-3 mg: 10 mg
液体糞便: 10 ul: 10 ul
DNA Genotek OMNIgene-Gut: 10 ul: 10 ul
組織: 20 mg: 30 mg
マウス糞便: 5 mg (1/4 ペレット): 10 mg (1/2 ペレット)
細菌細胞: 10^6: 10^8

バッファーの考慮事項: Shoreline Rapid PrepおよびShoreline Complete lysisステップはpHに依存するため、サンプルインプットの推奨ガイドラインに従うことが重要です。
もしサンプルをpH6.5未満のバッファーに保存する場合は、10 ?Lが最大インプット液量となります。
これ以上の液量を添加すると、最適な溶解が得られず、下流の結果に影響を及ぼす可能性があります。

Shoreline Completeキットには何が含まれていますか?

Shoreline Completeキットには溶解と精製サブキットと増幅サブキットが含まれています。

溶解と精製サブキットには以下のものが含まれています。
・溶解用の96ウェルプレートまたは16チューブ
・DNA精製ビーズのボトル2本またはチューブ

増幅サブキットには以下のものが含まれています。
・増幅用PCRプレートシール
・96種類のバーコードプライマーを含む96ウェルPCRプレートまたは16種類のバーコードプライマーを含む16チューブ
Illuminaの場合、これらのプライマーは16S rRNA遺伝子のV1-V3またはV4領域のいずれかをターゲットとしてします。PCR増幅後、Illuminaシークエンシングアダプターを含むアンプリコンをプール、精製しましたら、シークエンシングの準備ができています。
PacBioの場合、これらのプライマーは16S rRNA遺伝子全体または16S-ITS-23S領域のいずれかをターゲットとしています。PCR増幅後、アンプリコンをプールしましたら、PacBio SMRTbell調製の準備ができています。

Shoreline Completeキットに含まれていない追加の材料を購入する必要がありますか?

追加でご用意いただく必要がある物品がございます。

・磁気ビーズを扱うためのマグネット(Invitrogen DynaMag 96 サイド磁気ラック、品番12331D または磁気スタンド96 品番AM10027)。
Invitrogen DynaMag 96 マグネットを強くお勧めします。
ユーザーがこのタイプの磁石で最も成功していることがわかりました。
磁気スタンド96(サーモフィッシャー品番AM10027)は、他の唯一の承認された磁石です。
棒やポストではなく、ウェル型のマグネットを使用したプレートマグネットでは、DNA の収量が低くなります。

・PCR 後の洗浄には、Qiagen MinElute PCR Purification Kit (品番28004) を使用してください。

その他の必要なアイテムは、ほとんどのラボで共通して使用されており、各プロトコールに記載されています。

Shoreline Biome サンプルの前処理にはどのくらいの時間がかかりますか?

96サンプルの溶解、精製、増幅には約半日かかります。

Shoreline Completeキットにはビーズビーティングが必要ですか?

ビーズビーティングは必要ありません。Shoreline Completeの新規溶解法は、ビーズビーティングの必要を取り除きました。

Shoreline Biome SBAnalyzerとAthenaデータベースはV1-V9キットで使用できますか?

はい、SBAnalyzerはV1-V9、StrainIDとNanoID™キットに使用できます。ソフトウェアで解析を設定する際には、正しいキットを選択してください。

Shoreline Biome SBAnalyzerソフトウェアの要件は何ですか?

Linux CentOS 7、8とWindows 10で動作します。
その他の最低要件は以下の通りです。
・1TBのディスク容量(2TB推奨)
・32GB RAM (複数のSequel IIデータを解析する場合は64GBを推奨)
・CPU: 最低 インテル Core i7 4GHz 6コア プロセッサ
・Windows版Microsoft Excel、CentOS版LibreOffice

Shoreline Biome Athenaデータベースについて詳しく教えてください。

Shoreline Biome StrainIDキットは、特別にキュレーションされたAthenaデータベースへのマッピングを必要とするユニークなロングアンプリコンです。
AthenaはRefSeqゲノムから構築されており、包括的で統合された、冗長性のない、十分にアノテーションされたゲノムを含んでいます。
これらのゲノムの多くは、他のデータベース(HOMDなど)と重複しています。
現在、18,566のゲノムと77,212の16S-23S領域が登録されています(Athena V2)。

Shoreline Biome Athenaデータベースは他の公開データベースとどのように異なるのでしょうか?

16Sデータベース(SILVA, RDP, Riken, HOMDなど)を用いて、菌株レベルで分類学的に区別することは、データベースにどれだけのリードがあるかに関わらず、16S rRNA遺伝子には多くの種/株を区別するための十分な多様性がないために、一般的には不可能です。
16Sデータベースへのマッピングでは、スペーサー領域の配列に関する情報が含まれていないため、属レベルまでの推定しかできません。
同様の理由で、新規株の同定も不可能です。
遺伝子間のスペーサー領域配列は、近縁の菌株を区別するために重要な多様性が豊富に含まれています。
Athenaデータベースには、株レベルでの同定を可能にする、包括的で統合された、冗長性のない、十分にアノテーションされたゲノム由来の連続する16S-23S遺伝子配列が含まれています。

Shoreline Biome 自分の配列をデータベースにアップロードできますか?

こちらは現在のところで自身の配列はアップロードきませんが、ソフトウェアの将来のバージョンに向けて開発中です。

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