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ホーム > 製品情報 > 【機器】 一分子リアルタイムDNAシークエンサー PacBio®RS ll/Sequel™ システム

一分子リアルタイムDNAシークエンサー PacBio®RS ll/Sequel™ システム

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PacBio® RS II/Sequel™ システム

PacBio® RS II/Sequel™ システム

PacBio RS II/Sequel システムは一分子レベルでリアルタイムに塩基を読み取ることができるシークエンサーです(SMRT®DNAシークエンシング技術)。ほかのどの技術よりもはるかに長いリード(平均10,000bp)が出力されます。GCバイアスの無いキロベース単位の超ロングリードが均一のカバレッジで出力されることにより、バクテリアだけでなく、それ以上のゲノムサイズの生物のde novoアセンブリに大きく貢献します。

  RS II Sequel システム
 
日本販売開始時期 2011年(販売終了) 2016年
270 cm 93 cm
重量 900 kg 350 kg
平均リード長 約10kb
精度 1本リードあたり86%
原理 SMRT®DNAシークエンシング技術(一分子リアルタイムシークエンス)
1セルあたりのシークエンス時間 30分~360分 30分~600分
1ランの最大セル数 8セルx2本=16セル 4セルx4トレイ=16セル
1セルあたりの反応ウェル数 15万ウェル 100万ウェル
YouTubeでSMRT®シークエンシングの特長を見る YouTubeでSequelシステムのリリース情報を見る

適用ゲノム範囲

  • 医学研究

    ヒトの全ゲノムにわたる染色体レベルのフェージングに取り組むことで、いまだに明らかとなっていない多くのメンデル遺伝病や、複雑な疾患の遺伝性についての理解を深めることができます。

  • 動植物

    数ギガ塩基のゲノムサイズ、倍数性、難しいリピート領域など、動植物は複雑なゲノム構造を有しています。ゲノムを紐解くことで、干ばつや疾病といった農業および環境における課題を明らかにすることが期待されています。

  • 微生物および感染症

    世界の死亡率の23%以上は感染症に起因しており、抗生物質に対する薬剤耐性菌の出現がグローバルヘルスにおける脅威となっています。これらを理解し、早期解決を図るためには、病原体の包括的な特徴づけが必要です。

主な特長

SMRT®DNAシークエンシング技術の特長

1分子リアルタイム(SMRT®)テクノロジー

1分子リアルタイム(SMRT®)テクノロジーは、シークエンス分野における課題を克服する2つの鍵となる革新的技術を基盤にしています。Zero Mode Waveguide(ZMW)は、DNAポリメラーゼとテンプレートの複合体を固定したウェルの底面にのみ光を当てます。さらにリン酸結合した核酸を用い、DNAポリメラーゼが自然なDNA鎖の合成を行うところを観察します。SMRTセルは最大100万のZMWを搭載しており、リアルタイムに各ZMWを同時モニターします。

  • Zero-Mode Waveguide

  • Phospho-linked Nucleotide

  • SMRTセルあたり100万個のZMW

これまでの常識を覆す超ロングリード

40kb以上の最大リード長、10kb以上の平均リード長が得られるケミストリーを採用しています。数千塩基レベルのリード長により、PacBioRS II/Sequel システムはSNPsと大規模なゲノムの構造変化の両方を調べることが可能です。転写産物の全長を読めば、アイソフォームを同定するためにアセンブルをする必要はありません。ゲノムアセンブリにおいては、超ロングリードによりコンティグ数を大幅に減らすことができます。

典型的なSequel システムのパフォーマンス

30kbでサイズ選択したヒトライブラリーをSequel システム(10時間ムービー、2.0ケミストリー)で解析し、7.6Gbのデータを得ています。Sequel システムの各SMRTセルでは約365,000のリードを産出しました。

※サンプルの種類によってデータ出力量は上下します。

99.999%以上の正確なコンセンサス配列

得られたロングリードは99.999%のコンセンサス精度を達成し、de novoアセンブリやターゲットリシークエンスに絶大な威力を発揮します。テンプレート調製にPCR増幅が必須である第二世代シークエンサーと異なり、増幅時のエラー(GCバイアス)の影響を受けません。SMRT®DNAシークエンシング技術ではシークエンシングエラーがランダムに起こるため、コンセンサス配列作成時にエラーを取り除くことが可能です。結果として99.999%以上の精度のコンセンサス配列を決定することができます。

カバレッジあたりの精度

コンセンサス精度はカバレッジとケミストリーに相関します。上記のデータはSequel システム1.2ケミストリーによる微生物ゲノムの解析結果です。

高速なベースコール、短時間でデータ入手

毎秒数塩基ずつのポリメラーゼ反応と同時にベースコールが進行します。1セルあたりのシークエンシング反応時間は最大10時間です。データ解析には優れた二次解析ソフトウェアが用意されており、データから知見を得るまでの時間が短縮されます。

カスタマイズ可能な実験系

お客様のサンプルにあわせて実験系をカスタマイズできます。幅広い用途に柔軟に対応できるように、複数のプロトコルをご用意しています。

簡便性

シークエンスはリアルタイムでモニターされており、Sequelシステムの状態や結果、および実験内容はタッチスクリーンインターフェースに反映されます。使いやすいインターフェースで、データ解析や結果の閲覧ができます。

アプリケーション例

SMRT®DNAシークエンシングのアプリケーション例

完全長ゲノム配列の決定

全ゲノムショットガン法によるゲノム配列決定を試みたとき、ショートリードシークエンサーではゲノム中に散在する反復配列等がアセンブリ結果から特徴的に抜け落ちてしまい、バクテリアサイズのゲノムであっても完成させることは困難でした。しかしロングリードが得られるPacBioRS ll / Sequel システムでは、バクテリアサイズの完全長ゲノム配列決定を数セルで行うことが可能です。最近では60kbを超えるポリメラーゼリードを得ることも難しくなく、インサート長30kbのCHM1ライブラリをP6-C4ケミストリーで読み(PacBioRS ll)、6番染色体の長腕について、ほぼ読みきったといえる109 Mbpのcontigや、2番染色体の長腕の2/3をスパンする107Mbのcontigが得られました。

CHM1ゲノムのアセンブリ結果

ゲノムバリエーションの解析

ターゲットリシークエンシング

99.999%以上の高い精度のコンセンサス配列が得られるため、構造変異体などのゲノムの複雑な違いを明らかにすることができます。変異解析に適しています。個々のDNA分子を直接読み取っていくことで、希少なSNPsや挿入欠失変異を検出することができます。

連続する繰り返し配列のシークエンス

数100~数1000に及ぶ短鎖繰り返し配列(たとえばCGGリピート)や、ATリッチな配列を、最少のバイアスで読み取ることが可能です。

全長cDNAシークエンシング

SMRTシークエンスから得られるロングリードは、スプライシングバリアントの異なる発現遺伝子を一気にシークエンスできるので、より細かい遺伝子の分類・識別に効果を発揮します。

PacBioは、cDNA全体を読むことができるほど、長いリードを出力する。
ロングリードで解析すると、そこに確かに存在している1本の分子を、そのままの形でとらえることができる。

ロングアンプリコンシークエンス

HLAのタイピングなどシス/トランスのSNPをきちんとフェージングしたい場合に、クローニングなしのサンガーシークエンスあるいはショートリードシークエンスでは、その情報が失われてしまいます。しかしSMRTシークエンスなら、 シス/トランスの情報を保持したまま一気に読みきることが可能です。

エピゲノム分野への応用

リアルタイムに塩基を読み取る際に得られるカイネティクス情報から、塩基修飾も同時に検出することが可能です。

テンプレートの塩基が6mAのとき、
Tが結合するときのIPD (interpulse duration)は、
テンプレートがAのときに比べて5~6倍長い。
この6mAの平均IPDと、Aの平均IPDの比を取り判断する。

IPD (Inter Pulse Duration): パルスとパルスの間の時間情報(カイネティクス情報)

装置構成・ソフトウェア

ソフトウェアとデータ解析

Sequelシステム

本体(ベースコールサーバ含む)

ソフトウェア

Sequel システムには第三世代シークエンサーのデータを活かすための統合的なソフトウェア・ソリューションが備わっています。

  • ラン設定からデータ解析まで完全自動。手動での調整も可能。
  • 情報学研究者だけでなく,実験研究者や医療関係者にもユーザーフレンドリーなインターフェースのデザイン。
  • 汎用性の高い出力形式: FASTA, FASTQ,SAM/BAM,VCF など。
ソフトウェアとデータ解析

Sequel ソフトウェア SMRT Link

SMRT Link:
サンプルセット、ランのデザイン、シークエンス後のランのQC、二次解析などがここからできます。
二次解析ソフトウェア(SMRTAnalysis 4.0)には、以下の新しい解析メニューが含まれます。
  • 1. 二倍体のデノボアセンブリ(HGAP4)
  • 2. これまでより精度が上がったCircular Consensus Sequence (CCS2)
  • 3. その他、アンプリコンシークエンス解析、マッピング変異解析、完全長cDNA解析など
  • 4. PacBio RSIIから得られたデータを解析することも可能

データ解析(例)

データ解析

PacBioデータ単独でのアセンブリ (HGAP)

PacBioのロングリードだけでエラー補正からアセンブリ、Contig Polishingまでを自動で行うパイプラインをご用意しております。

Hierarchical Genome Assembly Process (HGAP)
Hierarchical Genome Assembly Process (HGAP)
  • 1. 一定以上の長さのリード(Seed Read)に、それ以下の長さのリードをマップし(BLASR)、エラーを補正する。
  • 2. 補正後の高精度ロングリード(Pre-Assembled reads)を使ってアセンブリを行う。
  • 3. Contigに対して再度サブリードをマップして、アセンブリのエラーを補正する(Arrow)。

Contig Scafollding

ショートリードシークエンサーのデータで作成したContigと、PacBioのロングリードのデータを組み合わせることで、Contig同士をつなげることができます。

全長cDNAシークエンシングのデータ解析 (Iso-Seq)

転写産物の全長を読めば,アイソフォームを同定するためにアセンブリは必要ありません。

PacBio Web Site :PacBio社のオフィシャルホームページ(論文やポスターのリンクもあります)
PacBioブログ :PacBio社マーケティングによる、オフィシャルブログ
「パックマンの挑戦」ブログ :PacBioシークエンサー関連の情報を提供する日本語ブログ
「PacBio People」ブログ :PacBioデータ解析情報を提供する日本語ブログ
Tomy Digital Biology Facebook :トミーデジタルバイオロジーのFacebook

Pacific Biosciences社が提供するDNAシークエンサーおよび試薬は研究目的のみに使用できます。
診断目的およびその手続き上での使用はできません。

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