
Pacbio RSの特徴
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一分子・リアルタイム(SMRT ®)検出は、個別の分子のダイレクトな測定を可能にし、これによって様々な次元のデータが捉えられるようになりました。PacBioPS用のテンプレート調製にはPCR による増幅が不要で、GC 含有量に関わらず幅広いゲノム領域で均一なシーケンス結果を得ることができます。これによって、ヘテロジニアスなサンプル中の、頻度の低い変異も検出に可能になります。
合成と検出を同時に行う非常に効率の高いストランドディスプレイシングDNA ポリメラーゼを利用してリアルタイムに一分子シーケンスを行う間、装置は反応に関与しているそれぞれのヌクレオチドのカイネティクスもあわせて記録しています。これによって、DNA のメチル化といったテンプレート配列の修飾も同定可能です。

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数千塩基レベルのリード長を実現したことで、PacBioRSはSNPsと大規模なゲノムの構造変化の両方を調べることが可能になりました。長鎖のシーケンス結果で、ハプロタイプ相の決定による病気の遺伝率について理解を深めることができます。また、コンティグ数を減らすことができるので、ゲノムアセンブリを単純化し効率を高めてくれます。さらに、他の同様な高いカバレッジをもつ技術と比べてはるかに正確性の高いコンセサンサス配列を得られます。

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毎秒数塩基ずつのポリメラーゼ反応と同時に配列解析が進行します。サンプル調製を4 ~ 6 時間という短い時間で行うことができ、シークエンシング反応時間もきわめて短くなっているため、何週間もかけずに、数時間で生物学的に意味のあるデータを手に入れることができます。データ解析のために、我々が用意した強力なSMRT 解析ツールにより、データから知見を得るまでの時間が短縮されます。

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安価な消耗品と調節可能な反応条件によって、実験系をカスタマイズできます。 幅広い用途に柔軟に対応できるように、複数のプロトコルを用意しています。
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増幅を行うことなく、数時間でサンプルを調製できます。シーケンスはリアルタイムでモニターしており、PacBioRSの状態、結果の内容、お よび実験内容はタッチスクリーンインターフェースに反映されます。使いやすいインターフェースでデータ解析や、結果の閲覧ができます。 全体のワークフローはサンプル調製から装置の使用、データ解析といったように、ユーザーが考える流れにそって設計されています。
Pacbio RSのアプリケーション例
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PacBioRSは一分子の高い精度、長いリード長、条件設定の柔軟さにより変異解析に適しています。個々のDNA 分子を長鎖リード長で直接読み取っていくことで、希少なSNPs、挿入欠失変異、構造変異体、ハプロタイプ、相を含むゲノムの複雑な違いを明らかにすることができます。実験デザインは自由度が高く、数個の遺伝子あるいは、数百の遺伝子(例えばがん遺伝子)の解析にも対応し、終了までに1日とかからず、数時間で完了します。一分子レベルの解析により、ウイルスや腫瘍部位などの臨床サンプルを含むヘテロジニアスなサンプル間の違いを見分ける、大量に増やすことを前提にしたシーケンス技術では見えなかったサンプル間での違いを特定するといったことが可能になりました。

- ハイブリッド法
- 第二世代シーケンサーの短鎖リード長のデータと、PacBioの長鎖リード長のデータを組み合わせることで、より低価格かつ高いクオリティでゲノム解読を完了し、コンティグを減らします。
- 単独でのアセンブリ
- 微生物のゲノムをPacBioの長鎖リード長によってアセンブルする方法です。
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サンプル調製と反応時間が短縮されたことで、感染流行や生物学的防御、食品の安全管理、メタゲノミクスなどの場面で病原体を種レベルで特定できようになりました。
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PacBioの長鎖リード長によって、完全長のRNA 分子の解読が可能になり、スプライシングアイソフォームや融合タンパク質などの転写産物の構造も特定することができます。

1回の解析によって、MCF-7 の転写産物すべてをカバーできます。MCF-7 は乳がん細胞株として広く研究されており、がんにおける転写解析のモデルとして利用されています。上記の遺伝子は腫瘍形成との関連が示唆されているスプライシングアイソフォームを形成することが知られています。
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SMRTテクノロジーによって個々の分子の動的な変化も観測が可能になったことで、エピジェネティクス研究における広汎にわたる塩基修飾の検出が可能になります。SMRTテクノロジーは転写反応、RNAシーケンス、翻訳、リガンド-タンパク質の結合の観測において、すでに研究現場で利用されています。私たちは将来的な製品リリースに向けて、こうしたアプリケーションのさらなる開発と評価を進めております。
Pacbio RSのパフォーマンス仕様
| 項目 | X-long | Long |
|---|---|---|
| リード長の分布 | ||
| 平均 | 3,000bp | 2,500bp |
| 95%ile | 8,500bp | 6,000bp |
| 所要時間 | ||
| 反応時間 | 90分 | 45分×2回 |
| SMRT Cell1 つあたりの解析時間(初期設定後) | 2時間 | 2時間 |
| テンプレート調製からベースコールまでの時間 | 1日以内 | 1日以内 |
| マッピングが可能なデータ | ||
| SMRT Cell 当たりのリード数 | ≧22,000 以上 | ≧35,000 以上 |
| SMRT Cell あたりのマッピングが可能なデータ | 65MB | 90MB |
| 1 日に使用できるSMRT Cell 数 | 12 | 12 |
| 精度 | ||
| 1分子 | 99%@5× 環状コンセンサス | 99%@5× 環状コンセンサス |
| コンセンサス※ | 99.999%@30× | 99.999%@30× |
| サンプル調整 | ||
| 最小インプットDNA | 500ng※※ | 500ng※※ |
| サンプル調製時間 | 4~6時間 | 4~6時間 |
- λファージのデータに基づく。サンプルの種類によって性能は上下します。
- ※ E.Coli K12 株のデータに基づく。サンプルの種類によって性能は上下します。
- ※※ インサートの大きさによる。
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24SMRTCell/日の場合、20分の反応時間でランができます。
反応時間を45分より長くする場合は、1日あたり12SMRTCellまで使用できます。
λファージで、90分の反応時間としたときのデータ。サンプルの種類によって性能は上下します。
Pacbio RSのソフトウェアとデータ解析
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PacBio RS システムには第三世代シーケンサーのデータを活かすための統合的なソフトウェア・ソリューションが備わっています。ソフトウェアは第三世代シーケンサーの大きな特長である、素早い解析速度、長鎖リード長、柔軟性があり細かく調整できる実験条件、動的な情報、環状コンセンサス解析やストロボシーケンスといった新しいシーケンスモデルをサポートします。
- RUN設定から解析まで完全自動。手動での調整も可能。
- LIMS やサードパーティの開発ツールとの効率的な統合環境。
- 情報学研究者だけでなく、生物学者や医療関係者にもユーザーフレンドリーなインターフェースのデザイン。
- 汎用性の高い書き出し形式: FASTA, FASTQ, SAM/BAM, VCF など。
- 開発者ネットワークに開かれたオープンソース環境。

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- RS Remote
- 直感的なインターフェースで、反応時間と消耗品に関する情報を常時確認しながら、デスクトップ上で直接機器のモニターを操作できます。
- RS Touch
- PacBio RS の機器をタッチスクリーンで操作するためのアプリケーションです。機器の動作や、シーケンス開始を操作するほか、
リアルタイムの映像とシーケンス状況の観察、終了までの残時間を表示します。 - Primary Analysis
- PacBio ブレードセンターはリアルタイムでの画像生成、ベースコール(波形からの配列読み出し)、品質評価を行います。
シーケンス結果は速やかに次の解析へ移行でき、RS TouchやRS Remote で見ることができます。
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