一分子リアルタイムDNAシークエンサーPacBio® Sequel II/ IIe システム

PacBio®社の基盤技術

SMRT®(一分子リアルタイム)シークエンスでは、長く断片化したnative DNAを基にした自然なDNA合成を百万単位の小孔(ZMW)内で同時に行うことでデータを取得します。このSMRT®テクノロジーがPacBio®システムを支える基盤技術です。

SMRT®シークエンスの仕組み

SMRT®シークエンスの強み

長いリード長

出力される数十kbものリードは、ゲノムアセンブリや完全長転写産物のシークエンスに最適です。

高いコンセンサス精度

シークエンスデータには決まったパターンによるエラーが含まれず、結果としてサンガーシークエンス並みの精度(99.999%以上、QV50)を得ることができます。

均一なカバレッジ

他の技術のようにGC含量に左右されず、シークエンス全体にわたって均一なデータカバレッジを得ることができます。

一分子を読む

native DNA分子からは、高精度(99%)で比類ない長さのシークエンスデータを得ることができます。

エピジェネティクス情報を同時に解析

PCR不要のライブラリ調製法により温存された塩基修飾パターンを、シークエンス時に直接読み取ることができます(Sequelシステム)。

よりよいデータがもたらす新たな知見

先進の研究現場に新たな知見をもたらすために、正確で完全なシークエンスデータを得ることは担保されるべき点です。もうこれ以上、正確さやリード長で妥協する必要はありません。SMRTシークエンスは2つのシークエンスモードであなたの研究推進に貢献します。

HiFiリード|超高精度なロングリードデータを生み出す方法

CCS(circular consensus sequencing)モードがもたらすHiFiリードは、一塩基変異から構造変異まで多岐にわたる変異タイプの検出において、高い解像度をもたらします。

典型的なHiFiリードのパフォーマンス(Sequel II/ IIe システム)

Q20(精度99%以上)に達した15-20kbのリード数:
~2百万リード

SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0で調製したヒト由来ライブラリ(20kbでサイズ選択)を、Sequel IIシステム(ケミストリー2.0、ソフトウェア8.0、30時間ムービー)で解析したデータです。

PCR増幅を必要としないため
GC含有量に依存しない均一なカバレッジが得られる

グラフはヒト由来20kbのHiFiライブラリにおけるGC含有量ウインドウ毎の平均カバレッジを示します。(Sequel IIシステムを使用。ケミストリー2.0、ソフトウェア8.0)

ロングリード|長いリードが得られることを最大限に活かす方法

出力される数十kbものリードをCLR(continuous long read)モードとして扱うことで、複雑なゲノムにさえも高度なアセンブリ結果をもたらします。

典型的なロングリードのパフォーマンス(Sequel II/ IIe システム)

半分以上のリード長:>50kb
SMRTcellあたりのデータ量:~160Gb

SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0で調製したE.coli由来ライブラリ(35kbでサイズ選択)を、Sequel IIシステム(ケミストリー2.0、ソフトウェア8.0、15時間ムービー)で解析したデータです。

システマチックエラーが無く
Q50(精度99.999%)以上を達成

Sequel IIシステム(ケミストリー2.0、ソフトウェア8.0)で解析したハプロイドの微生物ゲノムのデータです。

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アプリケーション例

多様なゲノム構造の解析

全ゲノムショットガン法によるゲノム配列決定を試みたとき、ショートリードシークエンサーではゲノム中に散在する反復配列等がアセンブリ結果から特徴的に抜け落ちてしまい、バクテリアサイズのゲノムであっても完成させることは困難でした。しかしSMRTシークエンス(HiFiリード・ロングリード)では、複雑なゲノム構造の配列決定を行うことが可能です。最新のケミストリーでは100kbを超えるポリメラーゼリードを得ることも難しくなく、数100~数1000に及ぶ短鎖繰り返し配列決定にも威力を発揮します。欠失・挿入・増幅・逆位・転座などの複雑なゲノム構造を明らかにしたり、ATリッチな配列を最少のバイアスで読み取ることも可能です。

15kbインサートのヒトゲノム(HG002)由来HiFiライブラリを、Sequel IIシステム(ケミストリー2.0、ソフトウェア8.0)で解析し、The Genome in a Bottle small variant benchmark (v3.3.2) に対して検証を行いました。15xのHiFiリードにより、SNVsは網羅性・正確性ともに99%以上の検出率でした。Small indelやSVsでも、95%以上と高い検出率を誇っています。

全長cDNAシークエンシング

SMRTシークエンスから得られるロングリードは、スプライシングバリアントの異なる発現遺伝子を一気にシークエンスできるので、より細かい遺伝子の分類・識別に効果を発揮します。

  • PacBioは、cDNA全体を読むことができるほど、長いリードを出力する。
  • ロングリードで解析すると、そこに確かに存在している1本の分子を、そのままの形でとらえることができる。

ロングアンプリコンシークエンス

HLAのタイピングなどシス/トランスのSNPをきちんとフェージングしたい場合に、クローニングなしのサンガーシークエンスあるいはショートリードシークエンスでは、その情報が失われてしまいます。しかしSMRTシークエンスなら、 シス/トランスの情報を保持したまま一気に読みきることが可能です。

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装置構成・ソフトウェア

Sequel II/ IIeシステム

  Sequel IIe Sequel II
対応SMRT Cell SMRT Cell 8M
精度99%以上のHiFiリード数 最大4,000,000*
ベースコール 本体内蔵サーバーで実施
HiFiリードデータ 本体内蔵サーバーで生成 SMRT Link(外部2次解析サーバー)で生成

* HiFiリード数はインサートサイズとサンプルクオリティにより変動します

全ての研究者に提供されるデータ解析ツール

  • SMRT Link:直観的に扱えるGUIをお試しください。コマンドラインによる解析も可能です。
  • PacBio DevNet:SMRTシークエンスのために開発された各種コミュニティツールをご紹介します。

PACBIO認証サービスプロバイダー

PacBio®認証サービスプロバイダーは、SMRTシークエンスを用いたサービスを展開する受託サービス機関です。厳格な技術トレーニングとベストプラクティスを学んだパートナーが、高品質な結果を提供します。

Sequel II タカラバイオ株式会社

お問い合わせ先
電話:077-565-6999
mail:info-sales@takara-bio.co.jp

Sequel II/IIe かずさDNA研究所

お問い合わせ先
電話:0438-52-3900
mail:ngs-jutaku@kazusa.or.jp

Pacific Biosciences社が提供するDNAシークエンサーおよび試薬は研究目的のみに使用できます。
診断目的およびその手続き上での使用はできません。

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